ma partie introduction... bonne lecture
(c'est juste pour aider au nombre de posts...
P.S. y'a pas les figures, vous ferez sans hein
1. Introduction 2
1.1. Rappel sur la fluorescence[1-3] 2
1.1.1. Un peu d'histoire 2
1.1.2. Principe 2
1.1.3. Applications 3
1.2. La fluorescence induite par absorption a deux photons 5
1.2.1. Absorption a deux photons 5
1.3. La génération de seconde harmonique 7
1.4. Sondes de pH 10
1.4.1. Méthode colorimétrique 10
1.4.2. Méthode utilisant des électrodes (pH-métrie) 11
1.4.3. Méthode par fluorescence 13
1.4.4. Principales sondes de pH utilisant la fluorescence 13
1.4.4.1. Sondes basées sur des complexes métalliques 13
1.4.4.2. Sondes basées sur les quantum dots 15
1.4.4.3. Sondes basées sur des chromophores organiques 16
1.4.5. Sondes deux photons 18
1.5. Sondes de polarité 22
1.6. Sondes de potentiel 29
1.7. Motivations et attendus du travail 34
1.8. Références bibliographiques 35
1. INTRODUCTION
1.1. Rappel sur la fluorescence[1-3]
1.1.1. Un peu d'histoire
La luminescence et les phénomènes de fluorescence sont connus depuis l'époque de l'antiquité. On trouve des exemples dans la mythologie et dans la bible avec les vers luisants. Néanmoins le premier écrit sur la fluorescence, décrivant la couleur bleuâtre a la surface d'une décoction de copeaux de bois Lignum Nephriticum, rédigé par Nicolas Monardes, ne date que de 1565.
Puis, lors du XIXe siècle, sir John Herschel, sir David Brewster puis sir Georges Stokes ont étudié de plus près le sulfate de quinine et ce dernier a prouvé que l'émission du sulfate de quinine a pour origine l'absorption des radiations ultra-violettes. C'est en 1852 que Stokes a introduit le terme de "fluorescence", car il avait remarqué que diverses variétés de fluorure de calcium émettaient de la lumière bleue. Cette émission n'était finalement due qu'a des impuretés contenues dans les cristaux. Le décalage entre la longueur d'onde d'absorption et d'émission de fluorescence a été appelé en son honneur "déplacement de Stokes"[4]. Il énonce que la longueur d'onde d'émission de fluorescence doit être plus importante que la radiation d'excitation.
1.1.2. Principe
Lors de l'absorption de lumière, le composé est porté dans un état excité. Il peut revenir a son état fondamental par plusieurs voies comme montré dans la Figure 1. Il peut donc y avoir émission de lumière ou non, et donc fluorescence. Plusieurs voies peuvent avoir lieu simultanément et entrer en concurrence avec la fluorescence, si elles se produisent sur des échelles de temps en accord avec les temps de demi-vie des molécules excitées. Ces diverses désexcitations modifient le spectre d'émission, le rendement quantique de fluorescence et la durée de vie de l'état excité du produit, ce qui peut donner des informations précieuses sur l'environnement proche de la molécule.
Temps caractéristiques :
Absorption 10-15 s
Relaxation vibrationnelle 10-12 – 10-10 s
Conversion interne (CI) 10-11 – 10-9 s
Durée de vie de S1 (fluorescence) 10-10 – 10-7 s
Croisement (ou passage) intersystème (CIS) 10-10 – 10-8 s
Durée de vie de T1 (phosphorescence) 10-6 – 1 s
Figure 1 : Diagramme de Perrin-Jablonski et temps caractéristiques des phénomènes physiques associés.[2]
Un grand nombre de paramètres physicochimiques peut agir sur l'émission de fluorescence d'une molécule comme représenté sur la Figure 2, et donc modifier les propriétés de fluorescence. Il est donc possible de les étudier en analysant la fluorescence des produits qui serviront ainsi de sondes.
Figure 2 : Diverses voies de désexcitation d'une molécule.
1.1.3. Applications
Les applications de la fluorescence sont très nombreuses. En particulier, la grande sensibilité de la fluorescence d'une molécule a son microenvironnement explique l'utilisation extensive des sondes fluorescentes dans de nombreux domaines : physique, chimie, biochimie, biologie, médecine, environnement, industrie pharmaceutique, etc.
Figure 3 : Effets d'environnement sur la fluorescence moléculaire.
Les sondes fluorescentes servent dans de nombreux domaines, comme par exemple :
- la détection des ions métalliques, anions, molécules neutres,
- la détection des anticorps, comme par exemple sur les puces a ADN,
- le controle du sang et des urines via divers paramètres (pH, sodium, potassium, chlorure, CO),
- le tri des cellules vivantes (mesures de cytofluorimétrie),
- l'étude des cellules par la visualisation des membranes, pHintracellulaire, potentiels de membrane, organisation membranaire, concentration en ions….
Trois classes peuvent être définies pour les sondes de fluorescence : les sondes intrinsèques, les sondes extrinsèques liées par covalence et les sondes extrinsèques associées via des interactions intermoléculaires.
Les sondes intrinsèques sont peu répandues (tryptophane, tyrosine, flavines…) mais idéales. Nous ne les traiterons pas ici. Les sondes extrinsèques sont soit associées, soit liées de façon covalente. Dans ce dernier cas, la localisation est connue précisément, contrairement aux sondes associées, ce qui est un avantage. On peut citer des exemples de sondes liées de façon covalente sur des groupes fonctionnels tels que les groupes amino avec des isothiocyanates. La fluorescéine est couramment utilisée dans ce but.
Le principal inconvénient de ces sondes liées de façon covalente est la difficulté de leur synthèse. C'est pourquoi la plupart des sondes extrinsèques utilisées sont associées de façon non covalente. Leur localisation est donc dépendante de la nature chimique de la sonde et des interactions spécifiques qu'elle peut avoir avec l'environnement.
1.2. L'absorption a deux photons
Dès 1929, Maria Göppert-Mayer a prédit dans le cadre de travaux théoriques l’absorption simultanée de deux photons (Figure 4).[5, 6] Ce processus non-linéaire n’a cependant été mis en évidence de façon expérimentale qu’après l’avènement des lasers dans les années 1960.[7, 8] En effet, l’absorption a deux photons (ou ADP) est un phénomène peu probable qui dépend de manière quadratique de l’intensité lumineuse et nécessite donc des puissances lumineuses très importantes ne pouvant être délivrées que par des lasers a impulsions. A partir du début des années 1990, l'ADP a commencé a donner lieu a diverses applications telles que le stockage tridimensionnel des données[9], l’imagerie biologique, la limitation optique[10, 11], l’up-conversion[12-14], la microfabrication[15], les télécommunications[15, 16]... Ces applications ont suscité un grand intérêt et motivé un nombre croissant de travaux visant l'élaboration d'absorbeurs a deux photons performants. De cette période date l'amorce d'une véritable ingénierie moléculaire de l'ADP. Les grandes lignes des travaux développés au cours des dernières années dans le domaine de l'imagerie biologique seront résumées dans ce chapitre afin de situer le travail développé au cours de la thèse dans un contexte général.
1.2.1. La fluorescence induite par absorption a deux photons
La section efficace d’ADP, notée 2, traduit la capacité d’un composé ou d’une molécule a absorber simultanément deux photons. Elle est mesurée en Göppert-Mayer (1 GM = 10-50 cm4.s.photon-1.molécule-1), unité donnée en hommage a Maria Göppert-Mayer qui fut la première a prédire ce processus.
Fluorescence induite par excitation a :
Microscopie de TPEF
(TPEF = Two-photon-excited fluorescence)
1 photon 2 photons
488 nm 1032 nm Probabilité 2..I2
2: section efficace d’ADP
: rendement quantique de fluorescence
I2è lasers pulsés + focalisation
2.è ingénierie moléculaire de fluorophores efficaces dans le domaine spectral recherché.
Figure 4 : Émissions induites par excitation a un photon (gauche) et deux photons (droite).
D’une manière théorique, 2, peut être reliée a , hyperpolarisabilité du 2ème ordre par l’expression :
Équation 1
où h est la constante de Planck ( = h/2) ; , la pulsation de la lumière ; n, l’indice de réfraction du milieu ; c, la célérité de la lumière et L, le champ local.
Soulignons également l’existence de règles de sélection spécifiques : l’absorption a deux photons ne peut avoir lieu que si les états initiaux et finaux sont de même parité (la règle opposée s’appliquant a l’absorption a un photon).
Ceci explique par exemple que dans le cas de molécules présentant un centre d’inversion, les états autorisés a un et deux photons ne soient pas les mêmes.
Enfin, il faut souligner que le couplage vibrationnel peut autoriser certaines transitions autrement "interdites" en ADP comme c’est le cas pour l’absorption a un photon.
Les caractéristiques de l’ADP sont sa dépendance quadratique avec l’intensité et le fait que l’on peut utiliser des longueurs d’onde deux fois plus élevées (typiquement dans le proche IR c’est a dire plus "douces") et donc pénétrant de façon plus profonde, moins invasives et moins destructrices pour les milieux biologiques. Par ailleurs, l’ADP permet – de par son caractère non-linéaire – une excitation extrêmement localisée et confinée au point focal (seul point où l’intensité lumineuse est assez élevée pour induire de l’ADP) et donne donc accès a une résolution 3D submicrométrique. L’ensemble de ces caractéristiques en font un outil de choix pour l’imagerie du vivant.
1.3. La génération de seconde harmonique
Une variante extrêmement prometteuse de la microscopie multiphotonique consiste a utiliser des chromophores non-linéaires actifs en génération de 2nde harmonique (SHG), ou de 3ème harmonique (THG). Ces chromophores sont en effet susceptibles lorsqu’ils sont irradiés dans la gamme des longueurs d’onde rouge-proche IR (c’est-a-dire dans la fenêtre d’intérêt biologique) de produire des photons dans le visible ou dans l’ultraviolet proche par un phénomène de doublement ou de triplement de fréquence.
TPEF SHG
Figure 5 : Comparaison entre les deux microscopies non-linéaires, la TPEF, incohérente, et la SHG, cohérente.
Ces nouvelles microscopies non-linéaires dites cohérentes (par opposition a la fluorescence multiphotonique, intrinsèquement incohérente) sont actuellement en plein essor de par le monde. Ces techniques bénéficient en effet de tous les avantages propres a la microscopie multiphotonique en ce qui concerne la faible toxicité, la forte profondeur de pénétration du rayonnement rouge–proche IR, et la haute résolution tridimensionnelle (pixel 1 m3). En outre, elles ouvrent la voie, de par leur caractère cohérent, a une description de l’ordre local (symétrie, organisation)[17]. Elles offrent notamment la possibilité d’accéder de façon non-invasive a des informations inaccessibles par microscopie de fluorescence. Ces techniques permettent par exemple d’accéder de façon non-invasive et in vivo aux propriétés spécifiques des cellules, telles que leur capacité d’organiser certaines molécules a l'intérieur de leur membrane (Figure 8 : excitation a 880 nm)[18].
L’imagerie SHG[19-22] présente les mêmes avantages que la TPEF :
- le phénomène est confiné au point focal de l'objectif du microscope, où l'intensité du laser est maximale. Cela permet, grâce a un balayage du laser, de réaliser une image en 3 dimensions avec une excellente résolution,
- l'utilisation de longueurs d’onde laser situées dans la gamme 700-1200 nm (proche IR) permet une meilleure pénétration dans les tissus biologiques, car cette gamme se situe au minimum d'absorption de la peau, du sang et de l'eau,
- ces rayons sont moins nocifs pour les tissus, ce qui permet d'observer des milieux vivants dans la durée sans les abîmer (imagerie in vivo).
Figure 6 : Spectre montrant l'émission de SHG simultanément a l'émission de fluorescence.
La SHG ne doit pas être confondue avec la TPEF. La TPEF donne lieu a un spectre d'émission plus ou moins large en fonction de la fluorescence de la molécule. En SHG, les deux photons ne sont pas absorbés par la molécule, mais diffusés de manière non-linéaire par doublement de fréquence, sous forme d’un seul photon d’énergie double. Le signal SHG sera donc toujours observé a une longueur d'onde exactement deux fois inférieure a la longueur d'onde du laser, indépendamment de la molécule utilisée et de ses propriétés d’absorption et d’émission (mais l’intensité du signal SHG dépend de la molécule et de la longueur d’onde utilisée).
En choisissant convenablement la longueur d’onde du laser, il est donc possible d’obtenir simultanément un signal 2PEF et un signal SHG, comme représenté ci-dessus. Ces deux signaux peuvent ensuite être discriminés spectralement, conduisant a deux images distinctes obtenues par filtrage spectral du double signal produit par les marqueurs (Figure 7).
Figure 7 : Microscope pour l'imagerie combinée SHG et TPEF (montage conçu par J. Mertz[18]).
Les microscopies de 2PEF (ou TPEF) et de SHG peuvent donc être utilisées de manière combinée. Elles conduisent a des images et a des informations différentes, comme le montrent les deux images ci-dessous enregistrées simultanément[18] (Figure
. L'image TPEF permet de suivre la localisation et la pénétration des marqueurs (présents dans la membrane mais également dans le cytoplasme, suggérant un processus d'internalisation), tandis que l'image SHG indique que les marqueurs sont bien incorporés dans la membrane de manière asymétrique, ce qui traduit un marquage privilégié du feuillet externe.
Figure 8 : Cellules de Xénope du Cap marquées par le N-(4-sulfobutyl)-4-(6-(4-(dibutylamino)phényl)hexatriényl) pyridinium (marqueur push-pull polyénique amphiphile) en 2PEF (gauche) et SHG (droite).
Le remplacement des techniques d’excitation monophotonique par les techniques multiphotoniques ouvre donc la voie a une imagerie plus "douce" et plus performante. Il faut toutefois souligner qu’a coté des avancées technologiques décisives en matière d’imagerie, on ne peut que constater le manque de marqueurs adaptés aux nouvelles techniques d’imagerie multiphotonique.
1.4. Sondes de pH
Le pH est un paramètre très important, que ce soit d'un point de vue physiologique ou industriel. La mesure du pH, mesure de routine très utilisée, trouve son application dans des secteurs très divers. Il gouverne en effet un grand nombre de réactions en biologie, il peut traduire l'existence d'une pollution dans le domaine de l'environnement, ou être révélateur d'un désordre métabolique en médecine.
Les sondes fluorescentes (ou indicateurs fluorescents) de pH offrent une bien meilleure sensibilité que les indicateurs classiques tels que la phénolphthaléine, le bleu de thymol, etc., fondés sur une variation de couleur. Elles sont de ce fait largement utilisées en chimie analytique et bioanalytique, en biologie cellulaire (pour la mesure du pH intracellulaire), et en médecine (pour suivre les variations du pH, pCO et pCO2 dans le sang). Il faut souligner également que le pH est un paramètre très important en biologie, notamment le gradient de pH qui est un moteur de la bioénergétique (photosynthèse, mitochondries).
Plusieurs méthodes existent pour mesurer le pH d'un milieu.
1.4.1. Méthode colorimétrique
De nombreuses substances chimiques prennent en solution une couleur qui dépend des conditions de pH. Cette propriété est mise a profit pour déterminer les caractéristiques du milieu en y introduisant l’indicateur sous forme de solution ou bien en utilisant une bandelette de papier imbibée d’indicateur : le papier-pH. Le choix du bon indicateur permet également de repérer l’équivalence au cours des titrages.
Dès le dix-septième siècle, Robert Boyle a utilisé des décoctions de plantes comme indicateurs colorés. Dans son ouvrage "expériences sur les couleurs" de 1963, il explique comment mettre en évidence le caractère acide des solutions a l’aide de sirop de violette. Il suggère de déposer quelques gouttes de sirop sur un papier blanc puis de déposer l’acide sur le papier : la tache de sirop passe du violet au rouge. Il donne ainsi le premier protocole expérimental de test d’acidité a l’aide d’un indicateur coloré et invente du même coup le papier-pH ! À la fin du dix-huitième siècle, on commence a utiliser les indicateurs colorés naturels dans les procédés industriels a des fins de controles. On constate alors que les solutions acides n’ont pas toutes le même effet sur les couleurs des indicateurs ; cela conduit a la mise au point des premières échelles de comparaison des forces des acides. Il faudra attendre encore un siècle pour développer les premières synthèses d’indicateurs : la phénolphtaléine en 1877 et le méthylorange en 1878. Le nombre des indicateurs ne cesse de croître et la variété de leur comportement vis-a-vis des différentes solutions acides et basiques est mal comprise jusqu’en 1894, quand Wilhelm Ostwald propose la première théorie des indicateurs : "L’indicateur est un acide ou une base faible dont les formes dissociées et protonées sont de couleurs différentes". Cette hypothèse s’avère exacte et la définition moderne la reprend en donnant plus de précisions : un indicateur coloré est un acide ou une base faible organique dont la structure interne change lors de l’échange de proton ce qui entraîne une variation de couleur.
Cette méthode a de nombreux avantages, tels que la facilité d'utilisation pour connaître le pH d'une solution ou lors d'un dosage, mais étant donné que l'on se base sur une variation d'absorption, il est nécessaire que le milieu ne soit pas trop absorbant lui-même afin de ne pas rendre la mesure impossible.
Figure 9 : Exemple d'indicateur colorimétrique commercial fixé sur papier : le papier pH.
Dans le cas de mesures dans un milieu hétérogène comme par exemple un organe ou un milieu cellulaire, cette méthode n'est pas optimale.
1.4.2. Méthode utilisant des électrodes (pH-métrie)
Le pH-mètre est, après la balance et le thermomètre, l'instrument de mesure le plus répandu dans les laboratoires d'analyse chimique (95% des laboratoires en sont équipés).
La mesure des pH repose sur l'utilisation de deux électrodes, combinées ou non, permettant de mesurer une différence de potentiel (E), égale a la différence de potentiel entre une électrode de référence et une électrode de mesure, et d'en déduire le pH du milieu étudié.
L'électrode de référence est généralement une électrode au calomel, saturée en chlorure de potassium. Cette électrode de référence, qui gardera un potentiel constant lors des mesures, est constituée d'une gaine de verre remplie d'un mélange intime mercure métallique Hg et dichlorure de dimercure (II), anciennement appelé chlorure mercureux, de formule Hg2Cl2. C'est ce "chlorure mercureux" qui est appelé "calomel". Le tout est en contact avec une solution saturée de chlorure de potassium. Un fil de platine parcourt l'électrode. Il permet la jonction au millivoltmètre qui fournit le "pH" de la solution aqueuse étudiée.
La jonction électrolytique avec la solution a étudier est assurée par une pastille poreuse, en bas de l'électrode. Le fonctionnement intime de l'électrode au calomel, saturée en KCl, symbolisée souvent par "E.C.S", repose sur le couple redox ion dimercure (II)/ mercure métallique Hg22+/Hg, dont la valeur du couple standard vaut 0,79 V a 25 °C, par rapport a l'électrode normale a hydrogène.
Si la solution est saturée en chlorure de potassium, le potentiel pris par l'électrode au calomel est de 0,24 V par rapport a l'électrode normale a hydrogène. C'est la valeur usuelle.
L'électrode de mesure est généralement une électrode de verre. Cette électrode est constituée d'un tube de verre, terminé a son extrémité par une boule, d'épaisseur très ténue, de l'ordre de 0,1 mm. L'intérieur est rempli d'un liquide déterminé, par exemple de l'acide chlorhydrique de concentration égale a 0,1 mol.L-1, dans lequel plonge une électrode de référence, constituée en général d'un fil d'argent recouvert de chlorure d'argent.
Comme l'électrode au calomel saturée en chlorure de potassium a un potentiel qui est fixe, la différence de potentiel globale entre l'électrode au calomel et l'électrode de verre sera de la forme :
Équation 2
Le millivoltmètre permettra donc, moyennant une adaptation de la graduation, de donner soit une différence de potentiel, soit, ce qui revient en fait au même, une valeur de pH. Il conviendra d'étalonner le pH mètre avec des solutions étalons, de pH connu, avant d'effectuer la moindre mesure. Les pH-mètres nécessitent que l'on règle le terme (approché) de 0,06, en fonction de la température des solutions. On étalonne en général les pH-mètres avec deux solutions étalons.
Cette méthode est très efficace pour une mesure du pH dans une gamme allant de 2 a 12 environ, mais n'est pas utilisable pour les pH extrêmes.
Même miniaturisée, une électrode ne permet pas de mesurer le pH dans des cellules de part sa taille et aussi du fait de la nécessité de pénétrer mécaniquement dans la cellule. Enfin, pour faire une cartographie d'un environnement, une électrode n'est pas du tout adaptée.
1.4.3. Méthode par fluorescence
Il faut tout d'abord rappeler que la valeur du pH est définie a partir de l'activité des ions hydronium , et non a partir de leur concentration, par la relation :
Équation 3
Une électrode de verre fournit une réponse qui est directement liée a l'activité des protons. Ce n'est pas le cas des méthodes optiques (spectrophotométrie et spectrofluorimétrie) utilisant des indicateurs de pH. En effet, ces méthodes sont fondées sur la détermination optique des concentrations de la forme acide [A] et de la forme basique
de l'indicateur. Le pH est alors déterminé en utilisant l'équation d'Henderson-Hasselbach :
Équation 4
Dans le cas des titrages fluorimétriques, cette équation peut être réécrite sous la forme :
Équation 5
I est l'intensité de fluorescence a une longueur d'onde donnée, IA et IB sont les intensités de fluorescence a la même longueur d'onde quand l'indicateur est respectivement exclusivement sous la forme acide ou sous la forme basique.
1.4.4. Principales sondes de pH utilisant la fluorescence
1.4.4.1. Sondes basées sur des complexes métalliques
En 2001 et 2003, T. Gunnlaugsson et al. ont travaillé sur des senseurs de pH basés sur des complexes d'europium. Ils sont efficaces, suivant le design, pour des pH acides ou des pH neutres. Ces sondes permettent, suivant le pH, d'observer soit l'émission due au chromophore complexant l'europium, soit l'émission de l'europium lui-même.[23, 24]
Figure 10 : Complexe d'europium pour la mesure du pH en milieu acide (1,5-3,5).
L'équipe de D. Parker a mis en place en 2007 une sonde ratiométrique de pH basée, elle aussi, sur un complexe d'europium ayant un pKa proche de la neutralité.[25] Le macrocycle utilisé est le même que celui de l'équipe de T. Gunnlaugsson ; seuls les substituants des azotes du cycle varient. Cette sonde peut passer la barrière membranaire et marquer l'intérieur d'organites intracellulaires.
Figure 11 : Variation de la structure du complexe d'europium en fonction du pH ; Microscopie de fluorescence confocale de fibroblastes de peaux de souris marqués avec le complexe d'europium. Barre : 20 µm.
Ces sondes ne permettent pas non plus d'avoir des variations différentes a deux longueurs d'onde séparées et donc de faire des mesures ratiométriques.
1.4.4.2. Sondes basées sur les quantum dots
En 2006, M. Raymo et al. ont développé un quantum dot greffé sensible aux pH basiques.[26]
L'intensité de fluorescence du cœur diminue par une transformation du chromophore qui permet un transfert d'énergie entre le quantum dot et le chromophore adsorbé. Cette variation peut être détectée afin de mesurer le pH, mais ne peut donner accès a une mesure ratiométrique.
Figure 12 : Gauche : intensité de fluorescence des quantum dots avec (a) et sans (b) chromophore en surface. Droite : solutions des quantum dots sous illumination UV.
Quelques mois plus tard, Y. H. Sun et al. ont étudié les propriétés en tant que sonde pH-métrique d'un quatum dot dans des cultures cellulaires.[27] Ces quantum dots ont montré une efficacité et une stabilité in vitro durant deux semaines.
Figure 13 : Quantum dots (rouge, gauche) dans des cellules marquées par du LysoTracker (vert, milieu) et la superposition des deux (droite).
Malheureusement, cette sonde ne peut pas, elle non plus, être utilisée en tant que sonde ratiométrique.
En 2007, S. Cao et al. ont développé un quantum dot modifié par l'acide mercaptoacétique afin de suivre l'évolution d'une réaction enzymatique catalysée par une lipase.[28] Leur système est dépendant du tampon, de la température, et ne possède qu'un seul maximum d'émission. Cela interdit donc de s'affranchir des conditions extérieures comme la concentration du marqueur, la température…
Comme on peut le remarquer sur ces exemples, la méthode permettant d'utiliser les quantum dots comme sonde ratiométrique et donc de d'affranchir de paramètres difficilement controlables n'est pas encore au point. Il est nécessaire de se pencher vers d'autres types de sondes, qu'elles soient a bases organique ou métallique.
1.4.4.3. Sondes basées sur des chromophores organiques
Les publications basées sur des chromophores organiques pour déterminer le pH par voie fluorescente sont très nombreuses, et donc il ne saurait être question d'en faire une liste exhaustive. Un grand nombre de publications aussi diverses que variées portent sur le sujet. En voici une sélection…
En 1993, J. Lakowicz et al. publient pour la première fois l'utilisation de la FLIM (imagerie par temps de vie de fluorescence) afin d'étudier le pH. En utilisant des sondes commerciales (Figure 14), ils ont étudié les variations d'absorption, d'émission mais aussi du temps de vie de fluorescence.[29]
Figure 14 : motif général de sondes utilisées par Lakowick et al. R1 = Cl, H ; R2 = Me, Et, H ; R3 = Me, H.
En 1998 et 2003, A. Safavi et al. ont utilisé des colorants communs tels que le victoria blue, le jaune de triazole ou la dipicrylamine fixé sur des membranes de cellulose afin de créer des optodes - des senseurs optiques mesurant une substance spécifique par l'intermédiaire d'un composé chimique - pour les pH extrêmes hauts et bas.[30, 31]
En 2004, R. C. Hunter et al. ont utilisé un dérivé de la semi-naphtofluorescéine (SNARF) afin d'étudier des biofilms de Pseudomonas aeruginosa en trois dimensions et les variations de pH en fonction de la position dans la matrice.[32]
Figure 15 : Images au microscope (a) normale et par microscopie laser confocale par mesure ratiométrique (b) d'un biofilm traité par C-SNARF-4 a 5 µm. Les valeurs sont des moyennes pour une surface de 50 µm². Echelle 40 µm.
La même année, J. R. Lakowicz et al. ont utilisé un acide boronique non sensible aux sucres comme sonde de pH ratiométrique ayant un pKa proche de 6. Cet acide est peu réactif envers les sucres jusqu'a 50 mmol/L de glucose et fructose.[33]
Figure 16 : Sonde ratiométrique a un photon avec pKa 6.
En 2005, Y. Xiang et al. ont utilisé la 2,6-diaminopyridine et des dérivés structuraux de celle-ci comme sondes ratiométriques de pH neutre. Leurs rendements quantiques sont bons et les deux molécules ont l'avantage d'être soit commerciales soit simples a synthétiser.[34]
Figure 17 : Les deux molécules phares en tant que sondes ratiométriques de pH dans le domaine des pH neutres.
En 2006, C. Plieth et al. ont utilisé la pHluorine, forme modifiée de la GFP (Green Fluorescent Protein), protéine très en vogue pour le marquage fluorescent des organismes. Dans ce cas la, ils ont suivi le pH par l'expression du gène de la Pt-GFP dans l'arabette des dames (Arabidopsis thaliana).[35]
Figure 18 : Intensité relative de fluorescence en fonction de la longueur d'onde pour différents pH (de 5 a 9).
1.4.5. Sondes deux photons
En 2002, J. Remington et al. ont utilisé une autre forme modifiée de la GFP (appelée deGFP) en tant que senseur de pH ratiométrique pour les pH proches de la neutralité.[36] L'étude parallèle d'un marqueur commercial, le SNARF-1, par incorporation dans les mêmes cellules, a montré que les deux sondes avaient une réponse temporelle identique, mais que les deGFP possédaient une réponse plus marquée et donc étaient de meilleures sondes, que ce soit a un ou deux photons.
En 2004, M. Blanchard-Desce et al. ont synthétisé et étudié deux quadripoles ayant une variation très marquée de leur réponse a deux photons en fonction du pH.[37]
L'incorporation de la molécule A dans une membrane modèle se fait suivant un agencement spatial de A dans la direction de la membrane. Cette molécule est néanmoins trop courte pour que ses extrémités pH-dépendantes soient en contact avec le milieu externe lorsqu'elle se trouve insérée dans la membrane.
Figure 19 : Gauche : Image TPEF d'une vésicule géante marquée avec A excitée avec une lumière polarisée horizontalement a l'axe de l'image ( = 780 nm, 1-3 mW/µm²), échelle 10 µm ; Droite : Spectre TPEF en milieu neutre (bleu) et basique (vert) de la membrane marquée avec A.
En 2005, P. D. Jobsis et al. ont étudié les propriétés en tant que sonde de pH de la 2,3-dicyanohydroquinone sous excitation a deux photons. Les deux formes (acide et basique) possédant toutes les deux une section efficace d'absorption a deux photons et des valeurs d'émission non négligeable, il est possible de l'utiliser comme une sonde ratiométrique. Son incorporation dans des cultures de fibroblastes d'embryons de souris (Figure 20) permet après traitement numérique de déterminer une carte du pH dans la cellule.[38]
Figure 20 : Mesure du pH d'un fibroblaste vivant de souris obtenu par microscopie TPEF (échelle : 20 µm).
À partir de 2004, L. Julien et al. ont publié dans plusieurs articles concernant les développements d'une famille de molécules basées sur le squelette 5-aryl-2-pyridyloxazole. Cette famille comprend des molécules très efficaces pour l'étude ratiométrique du pH que ce soit par excitation a un ou deux photons.[39, 40]
Figure 21 : Exemple de fluorophores absorbant a deux photons et sensibles au pH : la molécule PYMPON.
Le pKA de l'état excité a été déterminé par spectroscopie d’émission :
Figure 22 : Gauche : Variation des spectres d’émission en fonction du pH de la molécule PYMPON par excitation a un photon (courbe pleine) et a deux photons (courbe en pointillé) ; Droite : Spectre d’émission en fonction du pH de la molécule PYMPON.
Ce type de composé très récent présente toutefois une sérieuse limitation car sa section efficace d’absorption a deux photons demeure médiocre (typiquement inférieure a 20 GM), ou présente un pKA généralement basique, ce qui limite son application.
En 2006, P. Prasad et al. ont utilisé des nano-particules de silice modifiées par des chromophores organiques (OrMoSil pour Organically Modified Silica)[41] conduisant ainsi a des nanoparticules fluorescentes. Les chromophores pyridinium de surface ont, par transfert d'énergie depuis les chromophores de cœur non protonés, une réponse améliorée. Le rendement quantique ainsi que la section efficace de ces particules en environnements neutre et acide sont faibles (2 respectivement inférieurs a 0,2 et 50 GM). Leurs propriétés en tant que sondes ratiométriques sont prometteuses.
Figure 23 : gauche : précurseur silicaté avant assemblage en nanoparticules et condensation sol/gel ; droite : spectres d'absorption et d'émission (excités a 370 nm) a un photon du fluorophore non greffé (NPV) (neutre : trait plein, basique : pointillés, acide : cercles) pour la réalisation de nanoparticules fluorescentes permettant de sonder le pH.
Ces particules présentent des spectres d'émission et d'absorption (mono et biphotoniques) de leurs formes neutre et acide différents et très décalés. Ce sont donc des bons candidats pour des sondes ratiométriques de pH.
Figure 24 : gauche : spectres d'absorption a deux photons de la forme neutre (triangle) et acide (cercles) du fluorophore non greffé (NPV) en solution[41] ; droite : variation en fonction du pH du ratio des intensités de fluorescence de la sonde greffée (ORMOSIL) par excitation a un photon (cercles, excitation a 370 nm) et a deux photons (triangles, excitation a 780 nm).
Tout récemment en 2007, A. Jen et al. ont mis au point une série de senseurs pour les ions zinc et le pH.[42]
Figure 25 : Gauche : Famille de sondes développées par l'équipe de A. Jen. ; Droite : Spectres TPEF des formes neutre et basique de 3.
La sonde 3 présente de grandes variations, en fonction du pH a la fois de sa section efficace d'absorption a un ou deux photons et de son émission de fluorescence.
1.5. Sondes de polarité
La polarité est une caractéristique liée a la différence de positionnement des centres des charges positives par rapport a celui des charges négatives de la molécule.
La polarité (ou l'apolarité) d'une molécule influe sur ses caractéristiques, par exemple les molécules polaires sont facilement solubles dans d'autres composés polaires et pratiquement insolubles dans des composés apolaires. L'électronégativité est a l'origine de la polarité de certaines molécules. L'eau est la molécule polaire la plus répandue.
Une molécule polaire est caractérisée par son moment dipolaire : plus celui-ci est élevé, plus la molécule est polaire (il est nul pour les molécules apolaires). L'une des molécules les plus connues, l'eau, H2O, est fortement polaire.
Une molécule est polaire si :
- elle contient au moins une liaison covalente polarisée,
- le barycentre des charges partielles positives ne coïncide pas avec le barycentre des charges partielles négatives.
Dans le cas contraire elle est dite "apolaire".
Le concept de polarité est très délicat, il recouvre tous les types d’interactions soluté-solvant (y compris la formation de liaisons hydrogènes). La polarité de la bicouche lipidique a, par exemple, fait l’objet de nombreuses investigations y compris sur les modèles de membranes et les membranes naturelles.[43]
L'étude de la polarité dans les milieux biologiques a donné naissance a une nouvelle méthode de microscopie : la microscopie de fluorescence résolue en temps.[44, 45]
A la fin des années 1970, G. Weber et al. ont conçu et étudié de nouvelles sondes : le PRODAN (6-propionyl-2-diméthylaminonaphtalène) et son dérivé analogue le LAURDAN (Figure 26), porteur d’un acide gras (6-dodécanoyl-2-diméthylaminonaphtalène). Ce sont deux sondes que l’on peut qualifier de “multi-émissives”.[46, 47]
Figure 26 : Formule semi-développée du PRODAN et LAURDAN.
Leur but initial était d’étudier le phénomène de relaxation dipolaire. Le résidu naphtalène de ces sondes possède un moment dipolaire dû a une séparation partielle de charge entre les groupements 2-diméthylamino et 6-carbonyl. Lors de l’excitation, le moment dipolaire s’accroît et entraîne une réorientation des dipoles des molécules de solvant, ce qui se traduit par un déplacement bathochrome (red-shift) progressif dans le spectre d’émission de la sonde. Un schéma de ce processus de relaxation est donné dans la Figure 27.
Figure 27 : Schéma de la relaxation du solvant autour de la sonde avec un moment dipolaire plus élevé a l'état excité qu'a l'état fondamental.[2]
Ce phénomène de relaxation dipolaire du solvant n’est bien sûr observé que dans les solvants polaires. Une émission vers le bleu est observée pour les solvants apolaires, le spectre se déplaçant de plus en plus vers le rouge lorsque la polarité du solvant augmente. Par exemple, le maximum d’émission du LAURDAN se situe a 380 nm pour le dodécane, 460 nm pour le DMSO et 490 nm pour le méthanol.
Figure 28 : Spectres d'émission du PRODAN excité a 350 nm dans différents solvants (gauche a droite : cyclohexane, chlorobenzène, DMF, éthanol et eau).
Cette propriété des deux sondes a été largement utilisée en biophysique membranaire.
Le maximum d’émission de ces sondes dans des bicouches phospholipidiques dépend de la polarité locale et de la phase dans laquelle se trouve la membrane. L’origine de la relaxation dipolaire observée dans une bicouche phospholipidique a été attribuée aux quelques molécules d’eau présentes dans la bicouche au niveau du squelette glycérol, où se situent le LAURDAN et le PRODAN ; la réorientation de l’eau le long du dipole de la sonde a l’état excité ne pouvant survenir que dans la phase fluide.
Dans une bicouche phospholipidique, le LAURDAN est fortement ancré dans la partie hydrophobe par les interactions de Van der Waals existant entre sa chaîne d’acide laurique et les chaînes lipidiques, avec son noyau fluorescent localisé au niveau du squelette glycérol. Le LAURDAN étant pratiquement insoluble dans l’eau, son émission est entièrement issue d’un environnement phospholipidique. Le PRODAN, avec une chaîne propionyle plus courte, est plus faiblement ancré a la bicouche et est donc partiellement hydrosoluble. Par rapport au LAURDAN, le PRODAN est localisé plus près de la surface de la bicouche dans un environnement plus polaire, ce qui lui permet de sonder les molécules d’eau libres pouvant s’aligner plus facilement.
La sensibilité de ces sondes a la polarité locale et a la phase dans les membranes lipidiques a trouvé par ailleurs de nombreuses applications en biophysique membranaire. Le Rouge Nil (9-(diéthylamino)-5H-benzo[α]phenoxazin-5-one) (Figure 29) est une sonde fluorescente hydrophobe qui est largement utilisée dans l’étude des biosystèmes tels que les membranes,[48] les protéines[49] et les micelles.[50, 51] Comme les deux sondes précédentes, le Rouge Nil présente une grande sensibilité a la polarité de l’environnement.[52-55]
Figure 29 : Formule semi-développée du rouge Nil (Nile red).
Son rendement quantique augmente lorsque la polarité diminue et le spectre d’émission est déplacé vers le bleu. De même, sa fluorescence résolue en temps est fortement dépendante du solvant. Dans une certaine mesure, ce comportement du Rouge Nil laisse entrevoir des possibilités d’utilisations complémentaires au PRODAN et au LAURDAN, notamment par l’étude de la fluorescence résolue en temps.
En 1999, D. Madge et al. ont publié une étude indiquant l'effet du solvant sur des sondes de la famille des xanthènes (tels que la fluorescéine ou la rhodamine) par mesure de leur temps de vie de fluorescence.[56]
Figure 30 : Sondes étudiées par l'équipe de T. Akasheh.
Cette étude les a amenés a fournir des valeurs qui peuvent être utilisées pour des calibrations. Les modifications de temps de vie de fluorescence des deux formes de la rhodamine s'expliquent par un phénomène de conversion interne impliquant les substituants. Pour la rhodamine 6G et 101, les variations pourraient n'être dues qu'aux effets de variation d'indice de réfraction du solvant sur le temps de vie.
Figure 31 : Evolution du temps de vie de fluorescence des différents fluorophores en fonction du solvant.
En 2006, T. Akasheh et al. ont publié une étude relatant les effets sur divers polystyrènes para substitués du solvant.[57]
Ils ont noté que le solvant, en plus de modifier les spectres d'émission, augmente le temps de vie des monomères avec l'augmentation de la polarité, tandis qu'en même temps il diminue le temps de vie des excimères et le rendement quantique de fluorescence. Ceci peut s'expliquer par la formation d'un complexe entre le monomère et le solvant, qui permet un transfert d'énergie.
En 2005,[58] puis en 2007,[59] A. Okamoto et al. ont développé une famille de nucléotides fluorescents utilisant une base uracile. Ces molécules montrent des variations d'émission en fonction de la polarité du solvant.
Figure 32 : Famille de nucléotides fluorescents sensibles a la polarité du solvant.
Le nucléotide 1 possède une sensibilité a la polarité du solvant très marquée et peut sonder celle-ci par la variation de son maximum d'émission de fluorescence. Le nucléotide 2 présente un transfert de charge très marqué, ce qui en fait un fluorophore très sensible au solvant. Malheureusement, il n'est pas utilisable dans les solvants polaires de par son rendement quantique qui décroît énormément dans ceux-ci. Le nucléotide 3 présente une émission a des longueurs d'ondes plus grandes de par l'allongement du système conjugué. Etant donné que son émission change peu, il ne pourra pas être utilisé en étudiant son maximum d'émission, mais en observant les variations d'intensité en fonction de la micropolarité.
Figure 33 : Représentation du maximum d'émission des nucléotides 1, 2 et 3 en fonction de la polarité du solvant.
Ces dernières années, H. Y. Woo, C. Bazan et al. ont développé et étudié des sondes basées sur des squelettes [2.2]-paracyclophane[60, 61] et distyrylbenzène[62], par rapport a leurs propriétés d'absorption a deux photons en fonction du solvant.
Figure 34 : Chromophore distyrylbenzène (gauche) et motif de base des fluorophores a cœur [2.2]-paracyclophane (droite). R = structure conjuguée aromatique ; R1 et R2 = H, F, OMe, CN ; X = I, N+Me3I-.
Le chromophore distyrylbenzène a été fonctionnalisé aux extrémités (X) par des groupements neutres et chargés afin de pouvoir l'étudier dans divers solvants polaires et apolaires. La section efficace d'ADP possède un maximum dans le solvant THF, de polarité intermédiaire. La réponse dans l'eau subit une diminution. Diverses études théoriques[63, 64] ne coïncident pas avec les mesures expérimentales, probablement par que les interactions solvant-soluté comme les liaisons hydrogène ne sont pas prises en compte dans les modèles.
De la même façon, les chromophores a cœur [2.2]-paracyclophane possèdent aux extrémités conjuguées des groupements soit polaires soit apolaires afin d'étudier les chromophores dans une plus grande gamme de solvants. Dans ce cas, les variations de section efficace d'ADP suivent la même tendance mais les temps de vie intrinsèques augmentent lors du passage d'un solvant apolaire a un solvant polaire. Ces deux paramètres permettent d'utiliser ces sondes en tant que sondes par imagerie FLIM ainsi que d'étudier les micelles en milieu aqueux, les fluorophores s'incorporant dans les membranes et se trouvant dans un milieu apolaire, ils retrouvent des réponses bien supérieures a celles qu'ils ont dans l'eau.
Les sondes optimisées pour la spectroscopie de fluorescence multiphotonique résolue en temps sont encore peu nombreuses et ne remplissent pas toutes les conditions nécessaires pour une utilisation facile.
1.6. Sondes de potentiel
Le potentiel, et en particulier le potentiel de membrane, est un paramètre important pour les cellules et les organismes. Les variations du potentiel de membrane controlent ou accompagnent de nombreux processus biologiques, comme le transfert d'informations sur longues distances dans le réseau neuronal, les contractions musculaires…
Mesurer les potentiels d'action de neurones dans leur environnement naturel avec une haute précision temporelle et spatiale demeure un enjeu. Une des techniques permettant d'atteindre ce but est l'utilisation de sondes de potentiel. Ces sondes sont sensibles au potentiel de membrane. Le potentiel de membrane est la polarisation électrique d'une membrane plasmique. En introduisant une électrode de mesure a l'intérieur de la cellule, on constate une différence de potentiel (ddp) : le potentiel interne est négatif par rapport a une électrode de référence extracellulaire.
Cette différence de potentiel est due a la séparation de charge de part et d'autre de la membrane provoquée par un courant permanent majoritairement d'ions potassium a travers des canaux ioniques (Figure 35). Ce courant dissipe la force électro-osmotique causée par des différences de concentration entre différentes espèces ioniques. Cette différence de concentration est maintenue en permanence par l'activité des pompes sodium/potassium.
Figure 35 : Représentation schématique d'une membrane avec les canaux ioniques et les pompes sodium/potassium.
Le potentiel de membrane est une caractéristique universelle des cellules vivantes.
Lors des études in vitro, il est nécessaire de générer les variations de potentiel a l'intérieur des cellules étudiées. Des microélectrodes sont utilisées afin de fournir ces impulsions.
Figure 36 : Schéma de principe représentant un neurone avec le système d'électrode générant le courant.
Le potentiel d'action est défini comme une modification brutale, rapide et locale du potentiel de repos d'une cellule excitable. C'est cette différence de potentiel que les sondes de potentiel permettent de mesurer.
Le champ électrique étant localisé au niveau de la membrane, les sondes de potentiel nécessitent une incorporation dans la membrane elle-même : les changements dans le potentiel de membrane durant le potentiel d'action affecteront ainsi également les sondes, ce qui permettra de suivre le potentiel de membrane.
Il existe quatre familles principales de sondes du potentiel de membrane :
- les sondes sensibles a la variation rapide du voltage (Figure 37, haut gauche),
- les sondes a deux composants (Figure 37, haut droite),
- les systèmes basés sur une protéine GFP modifiée avec une sonde (Figure 37, bas gauche),
- les systèmes basés sur une protéine GFP modifiée avec un canal d'ion (Figure 37, bas droite).[65]
Figure 37 : Représentation schématique des principales de sondes du potentiel de membrane.
En 1994, S. Rohr et B. M. Salzberg utilisèrent divers marqueurs commerciaux (Figure 37, haut gauche) pour mesurer le potentiel de membrane via un détecteur multiple afin de sonder en parallèle plusieurs parties des cellules.[66] Ce système leur permettait de suivre l'activité électrique dans des cultures cellulaires de cœur de fœtus de rats. Il est possible d'obtenir une vue du temps nécessaire a l'influx électrique pour passer d'une zone de mesure a une autre, c'est-a-dire 15 µm. Ils ont pu ainsi montrer le couplage entre cellules cardiaques, endothéliales et fibroblastes.
Figure 38 : Gauche : vue de la préparation avec la grille superposée correspondant a la position des photodétecteurs ; droite : signaux mesurés par les détecteurs.
En 1997, R. Y. Tsien et J. E. Gonzà¡lez ont mis en place un système utilisant deux fluorophores, un fluorophore donneur (violet) a base de coumarine greffée sur un phospholipide, et un fluorophore accepteur (orange), un oxonol, entre lesquels un transfert d'énergie par fluorescence (FRET) peut se produire (Figure 37 haut droite).
Suivant le potentiel de membrane, l'accepteur se trouve d'un coté ou de l'autre de la membrane, du fait de la polarité membranaire. Cela crée donc une proximité plus ou moins importante entre les chromophores donneur et accepteur, et donc une variation de fluorescence détectable (Figure 39).[67]
Figure 39 : Schéma illustrant le principe du mécanisme du FRET. Gauche : a potentiel de membrane normal, l'accepteur se situe majoritairement du coté extracellulaire et permet donc le transfert d'énergie par fluorescence. Droite : après le potentiel d'action, l'accepteur se transfère du coté intracellulaire, ce qui diminue le transfert d'énergie.
En 2003, T. Knöpfel et al. ont utilisé des cellules de mammifères et d'ovocytes de xénope exprimant une protéine GFP modifiée fixée a un canal ionique de potassium (Figure 37, bas droite).[68] Ils ont, malgré les problèmes de sensibilité de la GFP au pH, réussi a avoir une sensibilité et une tolérance permettant des mesures de variations de potentiels de membrane.
Figure 40 : Senseur basé sur un système couplé protéine GFP (rouge et vert)-canal ionique (jaune).
Ces quelques exemples illustrent les diverses techniques existantes utilisant des marqueurs. Beaucoup d'autres publications a ce sujet existent.[69-75]
Il faut remarquer divers travaux utilisant les propriétés optiques intrinsèques de la membrane des neurones en fonction du potentiel de membrane tels les travaux de D. Kleinfeld et al.[76] Il est possible de déterminer a partir de la lumière diffusée le potentiel de membrane.
D'autres travaux montrent que l'utilisation de nouvelles techniques basées sur l'optique non linéaire, et en particulier sur la génération de seconde harmonique et sur la fluorescence émise par absorption a deux photons sont prometteuses pour la microscopie.[77-79]
Plusieurs groupes ont étudié théoriquement et expérimentalement la génération de seconde harmonique (SHG)[80] ainsi que la comparaison entre les deux méthodes (la TPEF et la SHG).[17, 22, 81]
Figure 41 : Schéma explicatif comparant le cas (gauche) où le signal SHG du marqueur n'est localisé qu'au niveau de la membrane neuronale et le cas (droite) de la TPEF où la fluorescence est non spécifique et vient du milieu extracellulaire (a), des cellules non neuronales (b, c) des organites (d) et du cytoplasme (e).
Durant les quelques dernières années, divers groupes ont travaillé sur des molécules push-pull conjuguées possédant a une extrémité un groupement aniline substitué et a l'autre un groupement pyridinium substitué. La conjugaison peut se faire par des liaisons doubles ou triples.
Figure 42 : Exemples de molécules push-pull.[82]
La fonction amine de ces molécules joue le role de groupement électrodonneur, le pyridinium joue le role d'électroattracteur, et les doubles ou triples liaisons de système transmetteur -conjugué. De plus, en greffant des chaînes alkyles sur l'aniline on obtient un groupement hydrophobe ; et le pyridinium servant de tête polaire, on a donc une molécule amphiphile.
Les molécules qui possèdent des doubles liaisons présentent l'inconvénient de pouvoir s'isomériser et sont donc moins photostables que celles qui possèdent des triples liaisons.
Ces molécules s'insèrent dans les membranes en gardant la tête polaire du coté extérieur (la pointe de la flèche dans la Figure 43). Une organisation spatiale non centrosymétrique des molécules est ainsi créée et donc le signal SHG est non nul. Une imagerie du potentiel membranaire par SHG est donc possible.[73, 81, 82]
Figure 43 : Représentation schématique d'une membrane et de la position d'insertion des molécules push-pull dans sa structure.
1.7. Motivations et attendus du travail
Les systèmes permettant de sonder le pH, la polarité du microenvironnement, ou le potentiel de membrane, via des processus non linéaires, sont encore assez peu nombreux. De plus, la réponse des composés décrits n'est pas assez importante pour les applications visées.
Nous nous proposons par conséquent de nous attacher a la préparation de nouvelles familles de sondes, en tentant de respecter ces différents critères. Nous détaillerons les caractéristiques photophysiques de ces molécules ainsi que leur efficacité a sonder le paramètre visé. Notre cahier des charges sera spécifique a chaque objectif des sondes, néanmoins il reste de commun que ces molécules devront répondre a deux critères primordiaux, c'est-a-dire une grande réponse moléculaire soit en TPEF soit en SHG afin de permettre une imagerie dynamique, et une sensibilité marquée pour le paramètre a sonder.
Plus précisément, le cahier des charges en fonction des sondes sera :
- pour l'imagerie de pH,
o un rendement quantique de fluorescence élevé,
o une section efficace d'absorption a deux photons importante (dans la gamme spectrale 700-1000 nm pour les applications biologiques),
o une émission de fluorescence dépendant du pH a deux longueurs d'ondes (sonde ratiométrique),
o une zone de variation de l'intensité de fluorescence la plus large possible en fonction du pH,
o une bonne affinité vis-a-vis du milieu a sonder,
o un pKA de l'ordre de 7 pour les applications biologiques ;
- pour l'imagerie de polarité,
o un rendement quantique de fluorescence élevé,
o une section efficace d'absorption a deux photons importante,
o une longueur d'onde d'émission et / ou un temps de vie de fluorescence fortement dépendant de la polarité du milieu ;
- pour l'imagerie de potentiel,
o une grande affinité pour les membranes et une insertion non centrosymétrique dans ces dernières,
o une hyperpolarisabilité élevée,
o une dépendance marquée de l'hyperpolarisabilité vis-a-vis du champ électrique.
1.8. Références bibliographiques
1. Valeur, B., Molecular Fluorescence: Principles and Applications. 2002, Weinheim: Wiley-VCH.
2. Valeur, B., Invitation a la fluorescence moléculaire. 2004, Bruxelles: De Boeck & Larcier s.a.
3. Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy. 1999, New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers.
4. Stokes, G.G., On the Change of Refrangibility of Light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 1852. 142: p. 463-562.
5. Göppert, M., The probability of co-operation of two light quanta in an elementary process. Naturwissenschaften, 1929. 17: p. 932.
6. Göppert-Mayer, M., Elementary processes with two quantum jumps. Titre anglais dans SciFinder: Elementary processes with two quantum jumps., 1931. 9: p. 273-94.
7. Kaiser, W. and C.G.B. Garrett, Two-photon excitation in CaF2:Eu++. Phys. Rev. Lett., 1961. 7: p. 229-31.
8. Peticolas, W.L., J.P. Goldsborough, and K.E. Rieckhoff, Double photon excitation in organic crystals. Phys. Rev. Lett., 1963. 10: p. 43-5.
9. Parthenopoulos, D.A. and P.M. Rentzepis, Three-dimensional optical storage memory. Science (Washington, D. C., 1883-), 1989. 245(4920): p. 843-845.
10. He, G.S., G.C. Xu, P.N. Prasad, B.A. Reinhardt, J.C. Bhatt, and A.G. Dillard, Two-photon absorption and optical-limiting properties of novel organic compounds. Opt. Lett., 1995. 20(5): p. 435-7.
11. Ehrlich, J.E., X.L. Wu, I.Y.S. Lee, Z.Y. Hu, H. Rockel, S.R. Marder, and J.W. Perry, Two-photon absorption and broadband optical limiting with bis-donor stilbenes. Opt. Lett., 1997. 22(24): p. 1843-1845.
12. Bhawalkar, J.D., G.S. He, C.-K. Park, C.F. Zhao, G. Ruland, and P.N. Prasad, Efficient, two-photon pumped green upconverted cavity lasing in a new dye. Opt. Commun., 1996. 124(1,2): p. 33-7.
13. Mukherjee, A., Two-photon pumped upconverted lasing in dye doped polymer waveguides. Appl. Phys. Lett., 1993. 62(26): p. 3423-5.
14. Abbotto, A., L. Beverina, R. Bozio, S. Bradamante, C. Ferrante, G.A. Pagani, and R. Signorini, Push-Pull Organic Chromophores for Frequency-Upconverted Lasing. Adv. Mater., 2000. 12(24): p. 1963-1967.
15. Cumpston, B.H., S.P. Ananthavel, S. Barlow, D.L. Dyer, J.E. Ehrlich, L.L. Erskine, A.A. Heikal, S.M. Kuebler, I.Y.S. Lee, D. McCord-Maughon, J. Qin, H. Rockel, M. Rumi, X.-L. Wu, S.R. Marder, and J.W. Perry, Two-photon polymerization initiators for three-dimensional optical data storage and microfabrication. Nature (London), 1999. 398(6722): p. 51-54.
16. Shi, Y., C. Zhang, H. Zhang, J.H. Bechtel, L.R. Dalton, B.H. Robinson, and W.H. Steier, Low (sub-1-volt) halfwave voltage polymeric electro-optic modulators achieved by controlling chromophore shape. Science, 2000. 288(5463): p. 119-122.
17. Mertz, J., Nonlinear microscopy. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series IV - Physics, 2001. 10: p. 1153-1160.
18. Moreaux, L., O. Sandre, S. Charpak, M. Blanchard-Desce, and J. Mertz, Coherent scattering in multi-harmonic light microscopy. Biophys. J., 2001. 80(3): p. 1568-1574.
19. Guo, Y., P.P. Ho, H. Savage, D. Harris, P. Sacks, S. Schantz, F. Liu, N. Zhadin, and R.R. Alfano, Second-harmonic tomographyof tissues. Opt. Lett., 1997. 22(17): p. 1323-1325.
20. Lewis, A., A. Khatchatouriants, M. Treinin, Z. Chen, G. Peleg, N. Friedman, O. Bouevitch, Z. Rothman, L. Loew, and M. Sheres, Second-harmonic generation of biological interfaces: probing the membrane protein bacteriorhodopsin and imaging membrane potential around GFP molecules at specific sites in neuronal cells of C. elegans. Chem. Phys., 1999. 245(1-3): p. 133-144.
21. Campagnola, P.J., H.A. Clark, W.A. Mohler, A. Lewis, and L.M. Loew, Second-harmonic imaging microscopy of living cells. J. Biomed. Opt., 2001. 6(3): p. 277-286.
22. Blanchard-Desce, M., Molecular engineering of NLO-phores for new NLO microscopies. C. R. Physique, 2002. 3(4): p. 439-448.
23. Gunnlaugsson, T., A novel Eu(III)-based luminescent chemosensor: determining pH in a highly acidic environment. Tetrahedron Lett., 2001. 42(50): p. 8901-8905.
24. Gunnlaugsson, T., J.P. Leonard, K. Senechal, and A.J. Harte, pH Responsive Eu(III)-Phenanthroline Supramolecular Conjugate: Novel "Off-On-Off" Luminescent Signaling in the Physiological pH Range. J. Am. Chem. Soc., 2003. 125(40): p. 12062-12063.
25. Pal, R. and D. Parker, A single component ratiometric pH probe with long wavelength excitation of europium emission. Chem. Commun., 2007(5): p. 474-476.
26. Tomasulo, M., I. Yildiz, and F.M. Raymo, pH-Sensitive Quantum Dots. J. Phys. Chem. B, 2006. 110(9): p. 3853-3855.
27. Sun, Y.H., Y.S. Liu, P.T. Vernier, C.H. Liang, S.Y. Chong, L. Marcu, and M.A. Gundersen, Photostability and pH sensitivity of CdSe/ZnSe/ZnS quantum dots in living cells. Nanotechnology, 2006(17): p. 4469-4476.
28. Yu, D., Z. Wang, Y. Liu, L. Jin, Y. Cheng, J. Zhou, and S. Cao, Quantum dot-based pH probe for quick study of enzyme reaction kinetics. Enzyme Microb. Technol., 2007. 41(1-2): p. 127-132.
29. Szmacinski, H. and J.R. Lakowicz, Optical measurements of pH using fluorescence lifetimes and phase-modulation fluorometry. Anal. Chem., 1993. 65(13): p. 1668-74.
30. Safavi, A. and H. Abdollahi, Optical sensor for high pH values. Anal. Chim. Acta, 1998. 367(1-3): p. 167-173.
31. Safavi, A. and M. Bagheri, Novel optical pH sensor for high and low pH values. Sensors and Actuators, B: Chemical, 2003. B90(1-3): p. 143-150.
32. Hunter, R.C. and T.J. Beveridge, Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol., 2005. 71(5): p. 2501-2510.
33. Badugu, R., J.R. Lakowicz, and C.D. Geddes, A wavelength-ratiometric pH sensitive probe based on the boronic acid moiety and suppressed sugar response. Dyes and Pigments, 2004. 61(3): p. 227-234.
34. Xiang, Y. and A.-J. Tong, Simple and efficient ratiometric fluorescent probes for near-neutral pH in aqueous solutions. Chem. Lett., 2005. 34(7): p. 926-927.
35. Schulte, A., I. Lorenzen, M. Boettcher, and C. Plieth, A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods, 2006. 2: p. No pp. given.
36. Hanson, G.T., T.B. McAnaney, E.S. Park, M.E.P. Rendell, D.K. Yarbrough, S. Chu, L. Xi, S.G. Boxer, M.H. Montrose, and S.J. Remington, Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry, 2002. 41(52): p. 15477-15488.
37. Werts, M.H.V., S. Gmouh, O. Mongin, T. Pons, and M. Blanchard-Desce, Strong modulation of two-photon excited fluorescence of quadripolar dyes by (de)protonation. J. Am. Chem. Soc., 2004. 126(50): p. 16294-5.
38. Joebsis, P.D., C.A. Combs, and R.S. Balaban, Two-photon excitation fluorescence pH detection using 2,3-dicyanohydroquinone: A spectral ratiometric approach. J Microsc., 2005. 217(3): p. 260-264.
39. Charier, S., O. Ruel, J.-B. Baudin, D. Alcor, J.-F. Allemand, A. Meglio, and L. Jullien, An efficient fluorescent probe for ratiometric pH measurements in aqueous solutions. Angew. Chem., 2004. 43(36): p. 4785-8.
40. Charier, S., O. Ruel, J.-B. Baudin, D. Alcor, J.-F. Allemand, A. Meglio, L. Jullien, and B. Valeur, Photophysics of a series of efficient fluorescent pH probes for dual-emission-wavelength measurements in aqueous solutions. Chem. Eur. J., 2006. 12(4): p. 1097-1113.
41. Kim, S., H.E. Pudavar, and P.N. Prasad, Dye-concentrated organically modified silica nanoparticles as a ratiometric fluorescent pH probe by one- and two-photon excitation. Chem. Commun., 2006(19): p. 2071-2073.
42. Tian, Y., C.-Y. Chen, C.-C
